蛋白質印跡法的步驟是什麼呢?
蛋白質印跡法是一種蛋白質檢測技術,最早是由美國人喬治.斯塔克發明的。它利用電泳技術把特定組織或細胞中的蛋白質分離出來,固定的NC膜或者PVDF膜上,再用特異性抗體檢測特定的抗原。正是能找到引起HRef="https://jingyanguan.com/zh-tw/tags-o8g-0.html" target="_blank" >疾病的抗原,這種技術現在已被廣泛用於疾病診斷等多個生物領域。下面我們來看看它的豬蹄步驟。
一、原理
與Southern Blot或Northern Blot雜交方法類似,但Western Blot法採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,“探針”是抗體,“顯色”用標記的二抗。經過PAGE(聚丙烯醯胺凝膠電泳)分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽型別及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測。
二、分類
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種:
i. 放射自顯影
ii. 底物化學發光ECL
iii. 底物熒光ECF
iv. 底物DAB呈色
現常用的有底物化學發光ECL和底物DAB呈色,體同水平和實驗條件的是用第一種方法,發表文章通常是用底物化學發光ECL。只要買現成的試劑盒就行,操作也比較簡單,原理如下(二抗用HRP標記):反應底物為過氧化物+魯米諾,如遇到HRP,即發光,可使膠片曝光,就可洗出條帶。測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表。
三、樣品製備
1.單層貼壁細胞總蛋白的提取:
2. 組織中總蛋白的提取:
3. 加藥物處理的貼壁細胞總蛋白的提取。
蛋白質印跡法,一種找出基因表達錯誤引起的疾病的方法。這種快速能找的導致疾病的抗原,並且特異性抗體(一種蛋白質)被著色的優勢,在研究遺傳疾病,基因問題,疾病的檢測上運用很多。在其製作的基礎上,也在不斷髮展出新的檢測技術,如Southern Blot雜交方法。
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