蛋白质印迹法的步骤是什么呢?
蛋白质印迹法是一种蛋白质检测技术,最早是由美国人乔治.斯塔克发明的。它利用电泳技术把特定组织或细胞中的蛋白质分离出来,固定的NC膜或者PVDF膜上,再用特异性抗体检测特定的抗原。正是能找到引起HRef="https://jingyanguan.com/tags-o8g-0.html" target="_blank" >疾病的抗原,这种技术现在已被广泛用于疾病诊断等多个生物领域。下面我们来看看它的猪蹄步骤。
一、原理
与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测。
二、分类
Western Blot显色的方法主要有以下几种:
i. 放射自显影
ii. 底物化学发光ECL
iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表。
三、样品制备
1.单层贴壁细胞总蛋白的提取:
2. 组织中总蛋白的提取:
3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取。
蛋白质印迹法,一种找出基因表达错误引起的疾病的方法。这种快速能找的导致疾病的抗原,并且特异性抗体(一种蛋白质)被着色的优势,在研究遗传疾病,基因问题,疾病的检测上运用很多。在其制作的基础上,也在不断发展出新的检测技术,如Southern Blot杂交方法。
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